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本试剂盒适用于快速从同一个动物细胞或者组织样品中同时提取分离基因组DNA和包含miRNA的总RNA和Protein(如购买额外miRNA吸附柱子和配套溶液，还可以将同一个样品的总RNA和miRNA分离并提取，富集miRNA。），不需要使用DNase消化，RNA可直接用于反转录PCR，荧光定量PCR。

本试剂盒设计用于快速从同一个动物细胞或者组织样品中同时提取分离基因组DNA和包括miRNA的总RNA和Protein。独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA/DNA酶，然后裂解混合物RNA/miRNA/DNA/Protein同时通过一个基因组DNA吸附柱，基因组DNA被吸附而miRNA/RNA/Protein穿透滤过。DNA吸附柱上基因组DNA经过一系列漂洗-离心后洗脱得到纯净基因组DNA。滤过的miRNA/RNA用乙醇调节结合条件后，miRNA/RNA在高离序盐状态下选择性吸附于miRNA/RNA吸附柱上，再通过一系列快速的漂洗-离心洗脱得到纯净的miRNA/RNA。滤液经选择性沉淀得到Protein。无苯酚、氯仿DNA/RNA快速提取技术基础上配合独特的分离技术同时得到的miRNA/RNA/基因组DNA纯度高，互不干扰。得到的miRNA/RNA不需要DNase消化，可直接用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。基因组DNA也可以直接用于下游的Southern、酶切、PCR等各种试验。

1. 完全不使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
   
2. 快速，简捷，单个样品miRNA/RNA/基因组DNA/Protein分离操作一般可在1小时内完成。
   
3. 独特吸附柱和配方确保有效清除基因组DNA残留，一般情况下得到的miRNA/RNA不需要DNase消化可直接用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。
   
4. 多次柱漂洗确保miRNA/RNA/基因组DNA高纯度，可直接用于下游各种实验。

1. 所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。
   
2. 不合适的储存于低温（4℃或者-20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃～25℃）进行。
   
3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C或者类似离心机。
   
2. 第一次使用前请先在Wash Solution 1、Wash Solution 2/3、漂洗液WB中分别加入指定量无水乙醇，并做标记。
   
   1. 12mL的Wash Solution 1加入28mL无水乙醇。
      
   2. 10mL的Wash Solution 2/3加入42mL无水乙醇。
3. 样品处理量绝对不要超过基因组吸附柱DA和和RNA吸附柱RA处理能力，否则造成DNA残留或者产量降低。不同组织细胞种类RNA/DNA相差极大，例如胸腺脾脏DNA含量丰富，超过5mg就会超过柱子处理能力。COS细胞RNA含量丰富，超过3×10⁶细胞就会超过柱子吸附能力。所以开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时宁可使用较少的样品处理量，如细胞不超过3～4×10⁶，组织不超过10mg。将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。
   
4. 裂解液RLT Plus、抑制物去除液IR、Wash solution 1、Wash solution 2/3中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
   
5. 该试剂盒如需要用于植物样品尤其是多糖多酚次级代谢产物丰富的困难样品的DNA/miRNA/RNA提取，请咨询技术人员，可能需要用到其它试剂。
   
6. 如购买额外miRNA吸附柱子和配套溶液，还可以将同一个样品的总RNA和miRNA分离并提取，富集miRNA。请咨询我们。
   
7. 关于DNA的微量残留：
   一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留（DNase消化也无法做到100%无残留），本试剂盒，由于采取了本公司独特的缓冲体系和基因组DNA分离清除技术，绝大多数DNA已经被清除，不需要DNase消化，可直接用于反转录PCR和荧光定量PCR。个别特殊情况如DNA含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA表达量分析荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：
   
   1. 选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接区，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
      
   2. 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。

1. 样本处理：
   
   1. 组织培养细胞
      
      1. 收集<10⁷悬浮细胞到一个1.5mL离心管，对于贴壁细胞，孔板培养可以直接裂解，细胞瓶培养应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。
         
      2. 13000rpm离心10秒（或者300g离心5分钟），使细胞沉淀下来。完全吸弃上清，留下细胞团，注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。
         
      3. 轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬，加350μL（<5×10⁶细胞）或600μL（5×10⁶～1×10⁷细胞）裂解液RLT Plus，吹打混匀后用手剧烈振荡20秒充分裂解。
         
      4. 匀浆：（处理细胞量极少时<1×10⁵一般不需要，涡旋振荡一分钟匀浆）。用带钝针头的一次性1mL(配0.9mm针头)注射器抽打裂解物5～10次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度防堵塞柱子和提高产量。
         
      5. 将裂解混合物或匀浆混合物全部加到DNA吸附柱上（吸附柱放在收集管内）。
         
      6. 接操作步骤项下3。
   2. 动物组织（例如鼠肝脑）
      
      1. 电动匀浆：新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块，加入350μL(<20mg组织)或者600μL(20～30mg组织)的裂解液RLT Plus后电动彻底匀浆20～40秒。
         
      2. 液氮研磨+匀浆：在液氮中研磨组织成细粉后，取适量组织细粉(20mg/30mg)转入装有350μL/600μL组织裂解液RLT Plus的1.5mL离心管中，用手剧烈振荡20秒，充分裂解。用带钝针头的一次性1mL(配0.9mm针头)注射器抽打裂解物10次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度防堵塞柱子和提高产量。
         
      3. 将匀浆后裂解物13000rpm离心3分钟，沉淀可能存在的裂解困难的碎片或者不溶物，将裂解物上清全部加到DNA吸附柱上（吸附柱放在收集管内）。
         
      4. 接操作步骤项下3。
   3. 13000rpm离心30秒，保留滤过液（miRNA/RNA/Protein在滤过液中）。DNA吸附柱子（膜上吸附有基因组DNA）短时间可存放4℃度备用。
      
      1. 确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。
2. 提取RNA：
   
   4. 用微量移液器较精确估计滤过液体积（350μL或者600μL左右，滤过时候损失体积应该减去），加入1.25倍体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
      
   5. 立刻将混合物(每次小于700μL，多可以分两次加入)加入一个RNA吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13000rpm离心30秒，保留滤过液以备提取Protein。
      
      1. 滤过液含有Protein，请转入一个合适大小（至少2倍滤过液体积）的离心管，保留被用于步骤17开始的Protein提取。装滤过液体和乙醇混合物的DNA吸附柱的收集管（混合物转入RNA吸附柱后剩下的空收集管）需要保留，将DNA吸附柱放回此收集管保留在4℃，备用于步骤11开始的基因组DNA提取。
   6. 加700μL Wash Solution 1（请先检查是否已加入无水乙醇!），12000rpm离心30秒，弃掉废液。
      
   7. 加入500μL Wash Solution 2/3（请先检查是否已加入无水乙醇!），12000rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μL Wash Solution 2/3，重复一遍。
      
   8. 将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
      
   9. 取出吸附柱RA，放入一个RNase-free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30～50μL RNase-free water，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟。
      
   10. 如得到的RNA可以立即用于下游反应或者尽快置于低温保存。
3. 提取DNA：
   11. 在步骤3的DNA吸附柱上加入500μL抑制物去除液IR，12000rpm离心30秒，弃废液。
       
   12. 加入700μL漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12000rpm离心30秒，弃掉废液。
       
   13. 加入500μL漂洗液WB，12000rpm离心30秒，弃掉废液。
       
   14. 将DNA吸附柱放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
       
   15. 取出DNA吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μL洗脱缓冲液EB （洗脱缓冲液事先在65～70℃水浴中预热效果更好），室温放置3～5分钟，12000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟。
       
       1. 洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于50μL，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。
   16. DNA可以存放在2～8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。
4. 提取蛋白：
   17. 将步骤5的滤过液中加入等体积的缓冲液APP，涡旋振荡混匀，室温放置15分钟沉淀Protein。
       
   18. 13000rpm离心5～10分钟，小心弃上清。加入0.5mL 70%乙醇，颠倒后离心1分钟，小心弃上清，留下蛋白沉淀，尽量将残留液体用移液器吸干净。
       
   19. 室温晾干沉淀5～10分钟，注意一定让乙醇挥发干净，以免下游试验受影响。
       
   20. 将蛋白沉淀溶解于30～150μL 1x蛋白上样缓冲液（如需要蛋白定量，缓冲液中不应该加入溴酚兰）或其它下游试验要求的缓冲液中。
       
       1. 由于裂解液RLT Plus强变性作用或者不同蛋白等电点，蛋白可能溶解比较困难，用移液器吹打帮助溶解或者改变PH值帮助蛋白溶解，短暂离心取上清使用。或者用5% SDS或者8M尿素帮助溶解蛋白沉淀后做蛋白定量。注意如果需要BCA蛋白定量可能需要把8M尿素稀释到3M。
   21. 95℃放置5分钟溶解和变性蛋白，回复到室温，最高速离心1分钟，取上清进行SDS-PAGE电泳或者western blot等试验。